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實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)必看干貨小結(jié)
點(diǎn)擊次數(shù):175 更新時間:2024-09-02

    實(shí)時熒光定量PCR (real-time quantitative polymerase chain reaction,Real-time qPCR),是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán),利用熒光信號積累實(shí)時監(jiān)測整個PCR進(jìn)程,最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析的方法。通常我們會重點(diǎn)關(guān)注Ct值(Cycle threshold ,Ct),其含義是:每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達(dá)設(shè)定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。


熒光定量PCR所使用的熒光化學(xué)可分為兩種:熒光探針和熒光染料。其原理如下:
1、TaqMan熒光探針:
PCR擴(kuò)增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針,該探針為一寡核苷酸,兩端分別標(biāo)記一個報告熒光基團(tuán)和一個淬滅熒光基團(tuán)。探針完整時,報告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號被淬滅基團(tuán)吸收;PCR擴(kuò)增時,Taq酶的5’-3’外切酶活性將探針酶切降解,使報告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離,從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號,即每擴(kuò)增一條DNA鏈,就有一個熒光分子形成,實(shí)現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成全同步。
2、SYBR熒光染料:
在PCR反應(yīng)體系中,加入過量SYBR熒光染料,SYBR熒光染料特異性地?fù)饺隓NA雙鏈后,發(fā)射熒光信號,而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會發(fā)射任何熒光信號,從而保證熒光信號的增加與PCR產(chǎn)物的增加全同步。
熒光染料也稱DNA結(jié)合染料,目前主要使用的染料分子是SYBR Green I,SYBR Green I能與DNA雙鏈的小溝特異性的結(jié)合,游離的SYBR Green I幾乎沒有熒光信號,但結(jié)合雙鏈DNA后,其熒光信號可呈數(shù)百倍的增加。隨PCR產(chǎn)物的增加,PCR產(chǎn)物與染料的結(jié)合量也增大,其熒光信號強(qiáng)度代表雙鏈DNA分子的數(shù)量。

我們將這條熒光擴(kuò)增曲線人為地分為基線期、指數(shù)擴(kuò)增期和平臺期三個階段:
1、基線期,擴(kuò)增的熒光信號被熒光背景信號所覆蓋,我們無法判斷熒光強(qiáng)度的變化。
2、擴(kuò)增期,熒光信號呈指數(shù)增長,擴(kuò)增產(chǎn)物的量與起始模板量存在線性關(guān)系,在此階段可定量分析。
3、平臺期,由于底物耗盡等因素.熒光信號不再呈指數(shù)增加。


RT-qPCR原理的三個主要步驟:

1 反轉(zhuǎn)錄:

使用逆轉(zhuǎn)錄酶和特定引物將RNA樣品反轉(zhuǎn)錄成cDNA

該步驟將RNA模板轉(zhuǎn)化為更穩(wěn)定且可擴(kuò)增的DNA形式。

反轉(zhuǎn)錄過程中使用特定引物。

 

2 、PCR擴(kuò)增:

使用特定引物對cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增,這些引物環(huán)繞目標(biāo)區(qū)域。

PCR是一個循環(huán)過程,呈指數(shù)級擴(kuò)增DNA模板的數(shù)量。

PCR反應(yīng)中包含熒光染料或探針,它們結(jié)合到擴(kuò)增的DNA序列上并發(fā)出熒光信號。

 

3 、熒光實(shí)時檢測:

使用實(shí)時PCR儀器實(shí)時監(jiān)測熒光信號。

熒光的數(shù)量與每個PCR循環(huán)中擴(kuò)增的DNA數(shù)量成比例。

使用專業(yè)軟件分析數(shù)據(jù)以確定循環(huán)閾值(Ct)值,該值表示熒光信號達(dá)到特定閾值水平所需的循環(huán)數(shù)。Ct值用于計(jì)算原始樣品中存在的目標(biāo)DNA量,從而允許進(jìn)行基因表達(dá)或病毒載量等定量分析。


實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)中有幾個重要的概念,包括擴(kuò)增曲線、基線、熒光閾值和域值循環(huán)數(shù)。
1、擴(kuò)增曲線(amplification curve:
是在實(shí)時熒光定量PCR中監(jiān)測到的熒光信號隨著循環(huán)數(shù)變化而繪制的一條曲線。在進(jìn)行PCR反應(yīng)過程中,通過檢測系統(tǒng)對PCR管內(nèi)的樣品進(jìn)行實(shí)時檢測,最后將熒光信號值通過成像技術(shù)顯現(xiàn)在計(jì)算機(jī)上。正常的擴(kuò)增曲線包括四個階段:基線期、指數(shù)增長期、線性增長期、平臺期。
2、基線(baseline):
是背景曲線的一段,在擴(kuò)增反應(yīng)的最初數(shù)個循環(huán)里熒光信號變化不大,接近一條直線。
3、熒光閾值(threshold):
是在熒光擴(kuò)增曲線指數(shù)增長期設(shè)定的一個熒光強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)(PCR擴(kuò)增產(chǎn)物量的標(biāo)準(zhǔn))。熒光閾值可以設(shè)定在PCR擴(kuò)增的指數(shù)期。
4、閾值循環(huán)數(shù):
表示每個PCR反應(yīng)管內(nèi)熒光信號達(dá)到設(shè)定的熒光閾值所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù),研究表明,各模板的CT值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系,即起始拷貝數(shù)越多,CT值越小;起始拷貝數(shù)越少,CT值越大。我們利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可做出以起始拷貝數(shù)的對數(shù)為橫坐標(biāo),CT值為縱坐標(biāo)的一條標(biāo)準(zhǔn)曲線。只要獲得未知模板的CT,即從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出該模板的起始拷貝數(shù)。