商品屬性：

超敏 ECL 顯色液用于 Western、Northern 和 Southernblot 分子雜交的化學(xué)發(fā)光檢測(cè)，比傳統(tǒng)化學(xué)顯色法靈敏度高，可達(dá) pg 水平。原理是采用新型發(fā)光底物（Luminol），其與辣根過(guò)氧化物酶反應(yīng)時(shí)產(chǎn)生很強(qiáng)的發(fā)光信號(hào)，在暗室中對(duì)X-光片感光，以此檢測(cè)微量蛋白而獲得理想的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。海基增強(qiáng)型 ECL 顯色液具有靈敏度高，持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)等特點(diǎn)。

應(yīng)用
在 Western 印跡分析，核酸雜交以及 EMSA 實(shí)驗(yàn)中，HRP標(biāo)記的二抗或探針與靶分子結(jié)合再與底物反應(yīng)產(chǎn)生可見(jiàn)光。
儲(chǔ)存：2-8°C，Super ECL A 要求避光保存。
操作方法（以 Western Blot 為例)
1．按每平方厘米膜面積用 0.1-0.2 ml 配置顯色液：根據(jù)顯色液的需要量，取等體積 A 液和 B 液，混勻后避光保存?zhèn)溆?；該顯色液必須現(xiàn)配現(xiàn)用。
2．2. 取出膜，平放在干凈的保鮮膜上，膜的正面（蛋白質(zhì)面）朝上，在膜的中央加適量的配置好的顯色液（6×8 cm 的膜加 2 ml 顯色液），溶液向四周迅速擴(kuò)散，覆蓋所有膜面。室溫保溫 5 分鐘左右，在此過(guò)程中請(qǐng)仔細(xì)觀察信號(hào)的出現(xiàn)。注意：如果信號(hào)強(qiáng)，在暗室中能很快看到陽(yáng)性信號(hào)出現(xiàn)。
3．3. 待信號(hào)出現(xiàn)且穩(wěn)定后，用鑷子夾起膜，除去多余的顯色液，平放在干凈的保鮮膜上，膜的正面（蛋白質(zhì)面）朝上，在轉(zhuǎn)移膜的上面再覆蓋一層保鮮膜，除去保鮮膜與轉(zhuǎn)移膜之間的空氣泡，請(qǐng)務(wù)必保證保鮮膜是干凈的，不被其他雜物或液體污染。
4．4. 在暗室中，將膜的正面對(duì)著 X-光片，放入暗盒。第一次曝光時(shí)間在 1 分鐘左右(有經(jīng)驗(yàn)的操作者可以根據(jù)信號(hào)的強(qiáng)弱自行決定)，立即按要求對(duì) X-光片進(jìn)行顯影和定影，確定最佳曝光時(shí)間。曝光時(shí)間從數(shù)秒到數(shù)小時(shí)不等；特別弱的過(guò)夜曝光也可。
注意
1.PVDF 膜較硝酸纖維膜能更好的結(jié)合蛋白，因此呈現(xiàn)較強(qiáng)的信號(hào)。選高質(zhì)量的 PVDF 膜；盡可能不用 Nylon 膜。
2.2.與抗體結(jié)合以后，要保證膜處于濕潤(rùn)狀態(tài)，否則會(huì)導(dǎo)致背景較高。
3.3.沒(méi)有信號(hào)的原因：有些抗體不識(shí)別變性抗原，有時(shí)需要考慮電泳過(guò)程對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的影響；樣品中無(wú)待測(cè)蛋白質(zhì)或含量過(guò)低；一抗效價(jià)低，用量少，可適當(dāng)增加一抗的用量；
4.4.背景過(guò)高原因：轉(zhuǎn)移膜封閉不充分；與抗體孵育后洗滌；膜在處理過(guò)程中過(guò)干；二抗用量過(guò)多等。
5.5.注意及時(shí)更換顯影液、定影液。

PCR基本步驟及注意事項(xiàng)？

一、實(shí)驗(yàn)原理

PCR是體外人工選擇性擴(kuò)增DNA的一種方法，它類(lèi)似于生物體內(nèi)DNA的復(fù)制。在生物體內(nèi)DNA復(fù)制需要模板、引物、DNA聚合酶、DNA解旋酶、 dNTPs；而體外PCR反應(yīng)同樣需要類(lèi)似的成分，有模板、引物、PCR Buffer、Taq酶、dNTPs。其中引物是人工設(shè)計(jì)的特定序列，實(shí)現(xiàn)對(duì)特定位置的擴(kuò)增；PCR Buffer提供一個(gè)反應(yīng)的緩沖環(huán)境；反應(yīng)過(guò)程同生物體內(nèi)一樣，DNA雙鏈打開(kāi)，引物結(jié)合模板，延伸形成新鏈。而這些過(guò)程在生物體內(nèi)靠DNA解旋酶解鏈，而在體外在通過(guò)控制反應(yīng)溫度實(shí)現(xiàn)的。如常用94℃變性模板DNA打開(kāi)雙鏈，在退火溫度處引物結(jié)合到模板上，最后在72℃完成延伸，并反復(fù)重復(fù)此過(guò)程即可實(shí)現(xiàn)對(duì)特定片段DNA的大量擴(kuò)增。到第三循環(huán)開(kāi)始才產(chǎn)生出和靶DNA區(qū)段相同的DNA分子，進(jìn)一步循環(huán)地產(chǎn)生出靶DNA區(qū)段的指數(shù)加倍。

在擴(kuò)增后期,由于產(chǎn)物積累,使原來(lái)呈指數(shù)擴(kuò)增的反應(yīng)變成平坦的曲線,產(chǎn)物不再隨循環(huán)數(shù)而明顯上升,這稱(chēng)為平臺(tái)效應(yīng)。平臺(tái)期(Plateau)會(huì)使原先由于錯(cuò)配而產(chǎn)生的低濃度非特異性產(chǎn)物繼續(xù)大量擴(kuò)增，達(dá)到較高水平。因此，應(yīng)適當(dāng)調(diào)節(jié)循環(huán)次數(shù)，在平臺(tái)期前結(jié)束反應(yīng)， 減少非特異性產(chǎn)物。到達(dá)平臺(tái)期(Plateau)所需循環(huán)次數(shù)取決于樣品中模板的拷貝。

二、主要的成分

1.模板可以是多種形式，主要包括基因組DNA、質(zhì)粒DNA、攜帶病毒的基因組DNA、PCR產(chǎn)物，cDNA等，但不能為RNA。對(duì)于不同類(lèi)型的模板，其主要不同在于預(yù)變性的時(shí)間以及模板的量。一般對(duì)于大的基因組DNA預(yù)變性時(shí)間10min足夠，質(zhì)粒DNA2min、攜帶病毒的基因組DNA預(yù)變性2min、PCR產(chǎn)物預(yù)變性2min即可。

注意cDNA為單鏈DNA，但仍可做PCR的模板，只不過(guò)在第一輪循環(huán)時(shí)只有一個(gè)引物結(jié)合，合成另一條鏈。從第二輪開(kāi)始，兩個(gè)引物均與特異位點(diǎn)結(jié)合，從而實(shí)現(xiàn)了與常規(guī)PCR的接軌。而同作為單鏈的RNA卻不能進(jìn)行PCR擴(kuò)增，原因就在于實(shí)現(xiàn)PCR反應(yīng)的是DNA聚合酶，只能特意識(shí)別DNA鏈。

2.對(duì)于模版的量來(lái)說(shuō)，一般25ul體系DNA的質(zhì)量為50—100ng。對(duì)于基因組DNA由于其結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜，提取的濃度也往往比較大，為防止?jié)舛冗^(guò)大對(duì)PCR造成影響，故需對(duì)提取的DNA進(jìn)行梯度稀釋。否則濃度過(guò)高則可能會(huì)引起非特異性擴(kuò)增。對(duì)于質(zhì)粒及PCR產(chǎn)物由于其結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，且提取濃度一般較低，則無(wú)需稀釋。

PCR實(shí)驗(yàn)中應(yīng)該注意的問(wèn)題有哪些?

沒(méi)有ct值

檢測(cè)結(jié)果遇到?jīng)]有Ct值情況,排查是否有以下問(wèn)題:

1、循環(huán)數(shù)不夠(一般不超過(guò)45循環(huán),不僅背景值提高,定量也不準(zhǔn));

2、PCR程序設(shè)置錯(cuò)誤,檢測(cè)熒光信號(hào)的步驟有誤。一般SG法采用72℃延伸時(shí)采集,TaqMan法則一般在退火結(jié)束時(shí)或延伸時(shí)采集信號(hào),另外熒光采集是否選中;

3、引物或探針降解?？赏ㄟ^(guò)PAGE電泳檢測(cè)引物和探針是否降解;

4、模板量可能降解或上樣量不足(不超過(guò)500ng,根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)即可), 對(duì)未知濃度的樣本應(yīng)從系列稀釋樣本的最高濃度做起;如果發(fā)生模板降解,應(yīng)考慮樣本準(zhǔn)備中雜質(zhì)的引入及反復(fù)凍融的情況,建議將模板樣本小量分裝儲(chǔ)備,避免反復(fù)凍融;

5、引物探針是否合適(尤其是引物跨越內(nèi)含子,以確保擴(kuò)增基因組DNA;上下游引物Tm值超過(guò)4℃以上也會(huì)影響擴(kuò)增)。

ct值過(guò)晚

在相對(duì)定量中, Ct值一般控制在15—25之間比較好,如果在絕對(duì)定量中, 對(duì)低拷貝數(shù)的樣品,Ct值會(huì)增大, 但是一般不宜超過(guò)40循環(huán), 否則定量不準(zhǔn)確。

因此,判斷Ct值出現(xiàn)過(guò)晚是否屬于非正常情況, 需要根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和目的進(jìn)行。

1、擴(kuò)增效率低。引物之間或者引物和探針的比例不合適, 需要進(jìn)行優(yōu)化;引物或探針設(shè)計(jì)不合理, 需要重新設(shè)計(jì);

2、PCR程序不合適, 改用三步法進(jìn)行反應(yīng), 或者優(yōu)化退火/延伸溫度, 可以適當(dāng)降低退火溫度; 退火/延伸時(shí)間短(可以在推薦的時(shí)間條件下延長(zhǎng)10s);

3、MgCl2濃度不合適,增加鎂離子濃度等。PCR各種反應(yīng)成分的降解或加樣量的不足;

4、PCR產(chǎn)物太長(zhǎng)。PCR產(chǎn)物設(shè)計(jì)超過(guò)500bp;

5、模板中存在抑制物。用高純度模板進(jìn)行PCR檢測(cè)或?qū)⒛０暹M(jìn)行稀釋。

公司正在出售的產(chǎn)品：