公司產(chǎn)品僅供科研研究使用、不得用于臨床診斷！

該 DP-Probe(DisPlaceable Probe)為鏈置換熒光探針，專用于LAMP 的熒光擴(kuò)增。Loop DP-Probe 在搭配 HotStart Bst4.2 Basic 試劑時(shí)表現(xiàn)出極為出色的特異性，可以大幅降低非特異性擴(kuò)增。LoopDP-Probe Pair 是將 Loop 引物進(jìn)行改造（LF/B 任意一條均可），其由兩條標(biāo)記引物退火組成：熒光猝滅引物（5’IBFQ+Tail+Loop）和熒光報(bào)告引物（Tail 互補(bǔ)區(qū)+3’發(fā)光基團(tuán)），其不發(fā)熒光。在 LAMP反應(yīng)中 Loop 引物滲入到“啞鈴"結(jié)構(gòu)，由擴(kuò)增返回“啞鈴"延伸并置換游離的熒光報(bào)告引物，累積產(chǎn)生熒光信號(hào)。有經(jīng)驗(yàn)的研究人員可根據(jù)參考文獻(xiàn)自行制備 LAMP Loop DP-Probe Pair，經(jīng)驗(yàn)不足的人員可委托  來制備， 提供三種熒光標(biāo)記的探針。需要客戶提供 Loop 序列，并指明需要的熒光標(biāo)記（FAM/JOE/ROX）。

eLAMP DP-Probe 試劑的開發(fā)簡述
1. 引物的粗篩選
無論是變色、試紙條、熒光法 eLAMP 試劑的開發(fā)，前期的測試過程， 推薦采用價(jià)格較低的液體 HotStart Bst4.2 SYBR Green試劑（進(jìn)行粗篩選。通常篩選的引物為 3-5 組。10xeLAMP Mix：FIP/BIP=8 μM each; LF/LB=4 μM each.測試樣品：10e3、100、25、10Copies/管，NTC(16-32 重復(fù))
2.5xBst4.2 SYBR Green Mix 10 μl
10x ePrimer Mix 2.5 μl
HotStart Bst 4.2（8U/μl） 1 μl
模板 DNA/RNA X μlddH2O 到總體積 25 μl置于 70°C 反應(yīng) 45min，1min 收集一次熒光信號(hào)。

良好的引物組具有 以 下 特 性 (Ct) ：

10e3copies =5-10min; 25copies <15min;10Copies<20min, NTC 均>40min. 以上實(shí)驗(yàn)需要反復(fù)確認(rèn)，以確
保核心引物的工作效率，否則重新篩選，再進(jìn)行后續(xù)的其它測試。
2. Loop DP-Probe Pair 的制備
根據(jù)上述引物組的篩選情況，選取最佳引物組。在此基礎(chǔ)上改造LF 或 LB，改造哪一條效果更佳，必須經(jīng)過測試。下面以改造 LF為例進(jìn)行說明。 通常提供 25x 的 LF DP-Probe Pair（或自行制備）。

注意：

（1）測試試劑更改為 HotStart Bst4.2 Basic 試劑。

（2）10xeLAMP Mix 引物濃度有調(diào)整。
10xeLAMP Mix：FIP/BIP=8 μM each; LB=4 μM；LF=3 μM.
2.5xBst4.2 Basic Mix 10 μl
10x ePrimer Mix 2.5 μl
25x LF DP-Probe Pair 1 μl
HotStart Bst 4.2（8U/μl） 1 μl
模板 DNA/RNA X μl
ddH2O 到總體積 25 μl
置于 70°C 反應(yīng) 45min，1min 收集一次熒光信號(hào)（注意根據(jù)探針熒光標(biāo)記，選取正確的熒光通道）。與 SYBR Green 結(jié)果相比來看，時(shí)間會(huì)滯后 1-3min。NTC 的控制會(huì)明顯提升。

此時(shí)可進(jìn)一步做后續(xù)的其它項(xiàng)目測試。
3. 如有試劑凍干制備的需求可采用如下幾種方案：
（1）(液體試劑)+PrimerMix 自行凍干（專業(yè)人員使用）。
（2）PrimerMix+(引物凍干劑)自行凍干，加入 (凍干球)。
（3）（HotStart Bst4.2），全程自行凍干（專業(yè)人員使用）。
（4）委托  進(jìn)行全體系凍干。

PCR 反應(yīng)需要使用哪些試劑和設(shè)備？

試劑:
模板DNA：PCR反應(yīng)需要模板DNA，如從細(xì)胞、組織、血液中提取DNA等；引物：PCR反應(yīng)的兩個(gè)引物，分別與模板DNA的兩端配對(duì)擴(kuò)增所需的特定區(qū)域，引物也可以合成為TA克隆等過程中使用到的引物；dNTPs：PCR反應(yīng)中需要四種dNTPs，包括脫氧腺苷酸（dATP）、脫氧胸苷酸（dCTP）、脫氧鳥苷酸（dGTP）、脫氧胞嘧啶酸（dTTP），用于細(xì)胞分裂、DNA合成等生物學(xué)過程，用于PCR擴(kuò)增的模板DNA鏈的延伸和擴(kuò)增；Taq DNA聚合酶：PCR反應(yīng)需要的聚合酶，一般使用Taq聚合酶，還有一些其他種類的聚合酶如PFU、Phusion等，用于擴(kuò)增DNA鏈；PCR buffer溶液：對(duì)PCR反應(yīng)具有緩沖作用，調(diào)節(jié)反應(yīng)pH，硫代硫酸氫鹽SDS、小分子有機(jī)化合物如甲醛，可增強(qiáng)PCR反應(yīng)特異性，從而提高反應(yīng)效率；酶切體系：PCR擴(kuò)增往往涉及到重組、構(gòu)建和測序等等實(shí)驗(yàn)步驟，常常需要進(jìn)行酶切操作。MARK:一種分子量標(biāo)準(zhǔn)，用來判別DNA片段大小的工具。DNA純化試劑盒：用于純化PCR反應(yīng)產(chǎn)物；
設(shè)備：
PCR儀：用于控制反應(yīng)溫度，保證PCR反應(yīng)時(shí)不同溫度環(huán)節(jié)的嚴(yán)格控制；電泳槽：用于分離PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；核酸提取儀：從組織樣本中全自動(dòng)提取核酸。  這些試劑和設(shè)備在PCR分子生物學(xué)技術(shù)中均是，只有在有序齊全的基礎(chǔ)上，才能進(jìn)行PCR反應(yīng)并得出準(zhǔn)確結(jié)果。

PCR相關(guān)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)：

PCR反應(yīng)基本步驟一般的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)由20到35個(gè)循環(huán)組成，每個(gè)循環(huán)包括以下3個(gè)步驟：

一、變性：

利用高溫（93-98℃）使雙鏈DNA分離。高溫將連接兩條DNA鏈的氫鍵打斷。在第一個(gè)循環(huán)之前，通常加熱長一些時(shí)間以確保模板和引物分離，僅以單鏈形式存在。該步驟時(shí)間1-2分鐘，接下來PCR儀就控制溫度進(jìn)入循環(huán)階段。

二、退火或稱接合,復(fù)性：

在DNA雙鏈分離后，降低溫度使得引物可以結(jié)合于單鏈DNA上。此階段的溫度通常低于引物熔點(diǎn)5℃。錯(cuò)誤的退火溫度可能導(dǎo)致引物不與模板結(jié)合或者錯(cuò)誤地結(jié)合。該步驟時(shí)間1-2分鐘。

三、延伸：

DNA聚合酶由降溫時(shí)結(jié)合上的引物開始沿著DNA鏈合成互補(bǔ)鏈。此階段的溫度依賴于DNA聚合酶。該步驟時(shí)間依賴于聚合酶以及需要合成的DNA片段長度。傳統(tǒng)的Taq估計(jì)合成1000bp/min、較新的Tbr（來自于嗜熱菌Thermus brockianus）約40秒、商業(yè)公司生產(chǎn)的融合型聚合酶僅需約10-15秒。

PCR反應(yīng)條件優(yōu)化：

1、變性溫度和時(shí)間：

保證模板DNA解鏈?zhǔn)潜ＷC整個(gè)PCR擴(kuò)增成功的關(guān)鍵。加熱90~95°C, 30~60s，再復(fù)雜的DNA 分子也可變性為單鏈。溫度過高或高溫持續(xù)時(shí)間過長，可對(duì)Taq酶活性和dNTP分子造成損害。

2、復(fù)性溫度和時(shí)間:

PCR擴(kuò)增特異性取決于復(fù)性過程中引物與模板的結(jié)合。復(fù)性溫度越高，產(chǎn)物特異性越高。復(fù)性溫度越低，產(chǎn)物特異性越低。需根據(jù)引物的Tm值具體設(shè)定。

3、延伸溫度和時(shí)間:

一般位于Taq酶最適作用溫度70~75°C之間。引物小于16個(gè)核苷酸時(shí)，過高的延伸溫度不利于引物與模板的結(jié)合，可以緩慢升溫到70~75°C。延伸反應(yīng)時(shí)間，可根據(jù)待擴(kuò)增片段的長度而定，小于1kb, 1min足夠；大于1kb需加長延伸時(shí)間。Taq酶可根據(jù)1kb/min增加時(shí)間。這里需要注意，延伸時(shí)間過長可能出現(xiàn)非特異擴(kuò)增。因此需要設(shè)置恰到好處的延伸時(shí)間。

4、循環(huán)數(shù):

其他參數(shù)選定后，PCR循環(huán)次數(shù)主要取決于模板DNA的濃度。理論上說20?25次循環(huán)后，PCR產(chǎn)物的積累即可達(dá)到最大值，實(shí)際操作中由于每步反應(yīng)的產(chǎn)率不可能達(dá)到100%，因此不管模板濃度是多少，20~30次是比較合理的循環(huán)次數(shù)。循環(huán)次數(shù)越多，非特異擴(kuò)增增加。

公司正在出售的產(chǎn)品：