公司產(chǎn)品僅供科研研究使用、不得用于臨床診斷！

保存條件：本試劑盒在室溫儲(chǔ)存 12 個(gè)月不影響使用效果。

產(chǎn)品介紹：
結(jié)合液/蛋白酶 K 迅速裂解細(xì)胞和滅活細(xì)胞內(nèi)核酸酶，然后基因組 DNA 在 高離序鹽狀態(tài)下選擇性吸附于離心柱內(nèi)硅基質(zhì)膜，再通過(guò)一系列快速的漂洗－離心的 步驟，抑制物去除液和漂洗液將細(xì)胞代謝物、蛋白等雜質(zhì)去除，最后低鹽的洗脫緩沖 液將純凈基因組 DNA 從硅基質(zhì)膜上洗脫。
產(chǎn)品特點(diǎn)：
1.重復(fù)性好:離心吸附柱內(nèi)硅基質(zhì)膜全部采用進(jìn)口特制吸附膜，柱與柱之間吸附量差異極小?？朔藝?guó)產(chǎn)試劑盒膜質(zhì)量不穩(wěn)定的弊端。
2.多次柱漂洗確保高純度，OD260/OD280 典型的比值達(dá) 1.7～1.9，長(zhǎng)度可達(dá) 30kb -50kb，可直接用于 PCR，Southern-blot 和各種酶切反應(yīng)。
注意事項(xiàng)：
1.結(jié)合液 CB 或者抑制物去除液 IR 低溫時(shí)可能出現(xiàn)析出和沉淀，可以在 37℃水浴幾分 鐘幫助重新溶解，恢復(fù)澄清透明后冷卻到室溫即可使用。

 2.避免試劑長(zhǎng)時(shí)間暴露于空氣中產(chǎn)生揮發(fā)、氧化、pH 值變化。
 3.結(jié)合液 CB 和抑制物去除液 IR 中含有刺激性化合物，操作時(shí)要戴乳膠手套，避免沾染皮膚，眼睛和衣服。若沾染皮膚、眼睛時(shí)，要用大量清水或者生理鹽水沖洗。

4.洗脫液 EB 不含有螯合劑 EDTA，不影響下游酶切、連接等反應(yīng)。也可以使用水洗脫， 但應(yīng)該確保批 pH 大于 7.5，pH 過(guò)低影響洗脫效率。用水洗脫 DNA 應(yīng)該保存在-20℃。 DNA 如果需要長(zhǎng)期保存，可以用 TE 緩沖液洗脫（10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH 8.0），但是 EDTA 可能影響下游酶切反應(yīng)，使用時(shí)可以適當(dāng)稀釋。
自備試劑：無(wú)水乙醇、1xPBS 緩沖液、RNase A（10mg/ml）（RNase A(10 mg/ml) 有售）。
操作步驟：
提示：第一次使用前請(qǐng)先在漂洗液 WB 中加入定量無(wú)水乙醇，充分混勻，加入后請(qǐng)及時(shí)在方框打鉤標(biāo)記已加入乙醇，以免多次加入!
如果需要去除 RNA，可在加蛋白酶 K 溶液前先加入 4μl RNaseA（10mg/ml）溶液振蕩 15sec，室溫放置 5 min

1.組織培養(yǎng)細(xì)胞
a. 收集約 105-10
6懸浮細(xì)胞到一個(gè) 1.5ml 離心管；對(duì)于貼壁細(xì)胞，應(yīng)該先用胰蛋白消化后吹打下來(lái)收集。
b. 12,000rpm 離心 10 sec，使細(xì)胞沉淀下來(lái)。棄上清，留下細(xì)胞團(tuán)和大約 10-20μl殘留的液體。
c. 加 200μl 1×PBS 重懸洗滌細(xì)胞，12,000rpm 離心 10 sec，使細(xì)胞沉淀下來(lái)。棄上清, 將細(xì)胞沉淀重懸于 180μl 1XPBS 中。
d. 加入 20μl 蛋白酶 K (20mg/ml)溶液，充分混勻（可選步驟：為清除 RNA，加入 5µl RNase A（10mg/ml），振蕩混勻，可選擇室溫放置 5min），再加入 200μl結(jié)合液 CB，立刻渦旋振蕩充分混勻，在 70℃放置 10 min。
e. 冷卻后入 200μl 無(wú)水乙醇，立刻渦旋振蕩充分混勻，此時(shí)可能會(huì)出現(xiàn)絮狀沉淀。
f. 將上一步混合物（包括可能有的沉淀）加入吸附柱 AC 中，（吸附柱放入收集管中）12,000rpm 離心 1 min，倒掉收集管中的廢液。
g. 按操作步驟 4 繼續(xù)后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。
2.動(dòng)植物組織（例如鼠肝腦或者植物葉片）
a. 新鮮或者解凍的組織在液氮中研磨成細(xì)粉后或者用解剖切成小碎塊（切成微塊可以提高產(chǎn)量）后取 20-50mg，轉(zhuǎn)入裝有 180μl 組織裂解液 TL 的 1.5ml 離心管中， 用大口徑槍頭吹打混勻。
b. 加入 20μl 的蛋白酶 K 溶液(20mg/ml)，立刻渦旋振蕩充分混勻。
c. 將裂解物放置在 55℃水浴 1-3 小時(shí)或者直到組織消化全，期間輕柔的振蕩幾次幫助裂解。為清除 RNA，加入 5µl RNase A（10mg/ml），振蕩混勻（可選擇室溫放置 5 min）。
d. 加入 200μl 結(jié)合液 CB，立刻渦旋振蕩充分混勻，70℃放置 10 min。
e. 冷卻后加入 200μl 無(wú)水乙醇，立刻渦旋振蕩充分混勻，此時(shí)可能會(huì)出現(xiàn)絮狀沉淀。
f. 用 1ml 的槍頭吸取混合物，將混合物加入一個(gè)吸附柱 AC 中，（吸附柱放入收集管中）12,000rpm 離心 1 min，倒掉收集管中的廢液。
g. 按操作步驟 4 繼續(xù)后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。
3.動(dòng)物組織（鼠尾）
a.將 0.2-0.5cm 的鼠尾巴尖(即 20-50mg)剪碎（一定要剪 0-2cm 范圍內(nèi)的尾巴尖，否則裂解效果不好），或者在液氮中研磨組織成細(xì)粉后，轉(zhuǎn)入裝有 180μl 組織裂解液 TL 的 1.5ml 離心管中， 用大口徑槍頭吹打混勻。
b.加入 20μl 的蛋白酶 K(20mg/ml)，立刻渦旋振蕩充分混勻。
c.將裂解物放置在 55℃水浴 3 小時(shí)或者直到組織消化全，期間輕柔的振蕩幾次幫助裂解。為清除 RNA，加入 5µl RNase A（10mg/ml），振蕩混勻（可選擇室溫放置 5 min）。
d.用一個(gè) 1ml 不帶針頭的一次性輸液抽打裂解物 2-3 次。
e.加入 200μl 結(jié)合液 CB 和 200μl 無(wú)水乙醇，立刻渦旋振蕩充分混勻。
f.12,000rpm 離心 5 min，將上清加入一個(gè)吸附柱 AC 中，（吸附柱放入收集管中）12,000rpm 離心 30-60 sec，倒掉收集管中的廢液。
g.按操作步驟 4 繼續(xù)后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。
4.加入 500μl 抑制物去除液 IR，12,000rpm 離心 30 sec，棄廢液。
5.加入 500μl 漂洗液 WB（請(qǐng)先檢查是否已加入無(wú)水乙醇!），12,000rpm 離心 30 sec，棄掉廢液。
6.重復(fù)操作步驟 5。
7.將吸附柱 AC 放回空收集管中，12,000rpm 離心 2 min，將吸附柱置于室溫放置數(shù)分鐘，以晾干吸附材料中殘余的漂洗液, 以免漂洗液中殘留乙醇抑制下游反應(yīng)。
8. 取出吸附柱 AC，放入一個(gè)干凈的離心管中，在吸附膜的中間部位加 50-100 洗脫緩沖液 EB（洗脫緩沖液事先在 65℃水浴中預(yù)熱效果更好），室溫放置 3-5 min，12,000rpm 離心 1 min。為了增加基因組 DNA的得率，將得到的溶液重新加入離心吸附柱中，室溫放置 2 min，12,000rpm 離心 1 min。(注意: DNA 產(chǎn)物應(yīng)保存在-20℃，以防 DNA降解。)

PCR 反應(yīng)需要使用哪些試劑和設(shè)備？

試劑:
模板DNA：PCR反應(yīng)需要模板DNA，如從細(xì)胞、組織、血液中提取DNA等；引物：PCR反應(yīng)的兩個(gè)引物，分別與模板DNA的兩端配對(duì)擴(kuò)增所需的特定區(qū)域，引物也可以合成為TA克隆等過(guò)程中使用到的引物；dNTPs：PCR反應(yīng)中需要四種dNTPs，包括脫氧腺苷酸（dATP）、脫氧胸苷酸（dCTP）、脫氧鳥苷酸（dGTP）、脫氧胞嘧啶酸（dTTP），用于細(xì)胞分裂、DNA合成等生物學(xué)過(guò)程，用于PCR擴(kuò)增的模板DNA鏈的延伸和擴(kuò)增；Taq DNA聚合酶：PCR反應(yīng)需要的聚合酶，一般使用Taq聚合酶，還有一些其他種類的聚合酶如PFU、Phusion等，用于擴(kuò)增DNA鏈；PCR buffer溶液：對(duì)PCR反應(yīng)具有緩沖作用，調(diào)節(jié)反應(yīng)pH，硫代硫酸氫鹽SDS、小分子有機(jī)化合物如甲醛，可增強(qiáng)PCR反應(yīng)特異性，從而提高反應(yīng)效率；酶切體系：PCR擴(kuò)增往往涉及到重組、構(gòu)建和測(cè)序等等實(shí)驗(yàn)步驟，常常需要進(jìn)行酶切操作。MARK:一種分子量標(biāo)準(zhǔn)，用來(lái)判別DNA片段大小的工具。DNA純化試劑盒：用于純化PCR反應(yīng)產(chǎn)物；
設(shè)備：
PCR儀：用于控制反應(yīng)溫度，保證PCR反應(yīng)時(shí)不同溫度環(huán)節(jié)的嚴(yán)格控制；電泳槽：用于分離PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；核酸提取儀：從組織樣本中全自動(dòng)提取核酸。  這些試劑和設(shè)備在PCR分子生物學(xué)技術(shù)中均是，只有在有序齊全的基礎(chǔ)上，才能進(jìn)行PCR反應(yīng)并得出準(zhǔn)確結(jié)果。

PCR相關(guān)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)：

PCR反應(yīng)基本步驟一般的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)由20到35個(gè)循環(huán)組成，每個(gè)循環(huán)包括以下3個(gè)步驟：

一、變性：

利用高溫（93-98℃）使雙鏈DNA分離。高溫將連接兩條DNA鏈的氫鍵打斷。在第一個(gè)循環(huán)之前，通常加熱長(zhǎng)一些時(shí)間以確保模板和引物分離，僅以單鏈形式存在。該步驟時(shí)間1-2分鐘，接下來(lái)PCR儀就控制溫度進(jìn)入循環(huán)階段。

二、退火或稱接合,復(fù)性：

在DNA雙鏈分離后，降低溫度使得引物可以結(jié)合于單鏈DNA上。此階段的溫度通常低于引物熔點(diǎn)5℃。錯(cuò)誤的退火溫度可能導(dǎo)致引物不與模板結(jié)合或者錯(cuò)誤地結(jié)合。該步驟時(shí)間1-2分鐘。

三、延伸：

DNA聚合酶由降溫時(shí)結(jié)合上的引物開(kāi)始沿著DNA鏈合成互補(bǔ)鏈。此階段的溫度依賴于DNA聚合酶。該步驟時(shí)間依賴于聚合酶以及需要合成的DNA片段長(zhǎng)度。傳統(tǒng)的Taq估計(jì)合成1000bp/min、較新的Tbr（來(lái)自于嗜熱菌Thermus brockianus）約40秒、商業(yè)公司生產(chǎn)的融合型聚合酶僅需約10-15秒。

PCR反應(yīng)條件優(yōu)化：

1、變性溫度和時(shí)間：

保證模板DNA解鏈?zhǔn)潜ＷC整個(gè)PCR擴(kuò)增成功的關(guān)鍵。加熱90~95°C, 30~60s，再?gòu)?fù)雜的DNA 分子也可變性為單鏈。溫度過(guò)高或高溫持續(xù)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，可對(duì)Taq酶活性和dNTP分子造成損害。

2、復(fù)性溫度和時(shí)間:

PCR擴(kuò)增特異性取決于復(fù)性過(guò)程中引物與模板的結(jié)合。復(fù)性溫度越高，產(chǎn)物特異性越高。復(fù)性溫度越低，產(chǎn)物特異性越低。需根據(jù)引物的Tm值具體設(shè)定。

3、延伸溫度和時(shí)間:

一般位于Taq酶最適作用溫度70~75°C之間。引物小于16個(gè)核苷酸時(shí)，過(guò)高的延伸溫度不利于引物與模板的結(jié)合，可以緩慢升溫到70~75°C。延伸反應(yīng)時(shí)間，可根據(jù)待擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度而定，小于1kb, 1min足夠；大于1kb需加長(zhǎng)延伸時(shí)間。Taq酶可根據(jù)1kb/min增加時(shí)間。這里需要注意，延伸時(shí)間過(guò)長(zhǎng)可能出現(xiàn)非特異擴(kuò)增。因此需要設(shè)置恰到好處的延伸時(shí)間。

4、循環(huán)數(shù):

其他參數(shù)選定后，PCR循環(huán)次數(shù)主要取決于模板DNA的濃度。理論上說(shuō)20?25次循環(huán)后，PCR產(chǎn)物的積累即可達(dá)到最大值，實(shí)際操作中由于每步反應(yīng)的產(chǎn)率不可能達(dá)到100%，因此不管模板濃度是多少，20~30次是比較合理的循環(huán)次數(shù)。循環(huán)次數(shù)越多，非特異擴(kuò)增增加。

公司正在出售的產(chǎn)品：